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상하이생명과학연구원, 고효율적이고 안전한 신형 RNAi 벡터 발명
등록일2015.10.21 조회수694
첨부파일 RNAi.docx 최근, 중국과학원 상하이(上海)생명과학연구원 생물화학·세포생물학연구소 국가단백질과학센터(상하이)의 우리강(吴立刚) 연구팀은 기존의 shRNA(short hairpin RNA)에 비하여 더욱 안전한 고효율 RNA 간섭(RNAi) 벡터-saiRNA를 발명하였다. 해당 연구 성과는 2015년 10월 12일 국제 학술 간행물 Nature Communications에 Ribozyme-enhanced single-stranded Ago2-processed interfering RNA trigger sefficient gene silencing with fewer off-target effects라는 제목으로 게재되었다. RNAi는 siRNA가 유도하는 상보적 서열을 함유한 RNA에 대한 특이적 분해 작용으로 전사 후 수준에서 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 현상이다. RNAi는 진핵 생물의 진화 과정에서 아주 보존적이므로 현재 이미 유전자 기능 연구에 광범위하게 응용되고 있고, 또한 마이크로 핵산 약물로 개발하여 직접 질병 치료에 이용할 수 있다. RNAi 기술을 광범위하게 응용됨에 따라 RNAi의 독성 부작용도 점차적으로 인식 및 보고되고 있다. 해당 독성 부작용은 주로 오프 타깃(off-target) 및 세포 내인성 miRNA에 대한 경쟁적 억제로 인한 것이다. 그러므로 더욱 좋은 RNAi 벡터를 설계하여 고효율적으로 표적 유전자를 침묵시키는 동시에 해당 독성 부작용을 감소시키는 것은 RNAi 기술 응용 과정에서 시급히 해결하여야 하는 핵심 문제이다. 우리강 연구팀의 박사과정 연구생 상런푸(尚仁福) 등은 서로 다른 머리핀 구조(hairpin structure)의 siRNA 전구체 가공 및 기능에 대한 연구를 심층적으로 진행한 토대에서 기존의 shRNA에 비하여 더욱 효율적이고, 오프 타킷 작용이 더욱 적은 신형 RNAi 벡터를 발명하였다. 현재 광범위하게 사용되고 있는 전통적인 shRNA에는 21bp 혹은 길이가 더욱 긴 이중 사슬 영역이 있다. 해당 설계는 shRNA의 이중 사슬 영역이 21bp보다 작으면 세포 내의 Dicer에 의하여 효과적으로 가공될 수 없고 또한 siRNA를 생성할 수 없다는 기존의 연구 결과를 기반으로 하였다. 연구팀은 siRNA 전구체를 설계할 때 이중 사슬 영역의 길이가 21bp보다 작은 siRNA 표적 영역을 가장자리 부근에 있는 고리 모양 영역으로 확장한 결과, 이중 사슬 영역이 16~18bp인 siRNA 전구체의 가공은 Dicer에 의존하지 않았고, RNAi의 핵심 단백질 Ago2에 의하여 직접 이중 사슬 영역 3’ 곁사슬(3’ arm)의 제10번째 염기 위치에서 절단되며, 생성물은 세포내의 엑소뉴클리아제(exonuclease)에 의하여 3’ 단에서 한층 더 절단되어 마지막으로 길이가 24~27nt인 단일 사슬 siRNA를 형성하였다. 연구팀은 해당 구조 특성을 갖고 있는 siRNA 전구체를 saiRNA(single-stranded Ago2-processed interfering RNA)라고 명명하였다. saiRNA가 의존하는 Ago2의 가공 경로는 세포내의 일종 특수한 miRNA(miR-451)의 가공 경로와 아주 유사하고, 또한 길이가 shRNA 와 saiRNA 사이에 있는 siRNA 전구체는 Dicer 및 Ago2에 의하여 가공될 수 없으므로 침묵 활성이 거의 없다. 심층적인 연구를 진행한 결과, saiRNA 머리핀 구조의 3’ 단 오버행(overhang) 길이가 Ago2의 결합 효율에 결정적 작용을 일으킨다는 것을 발견하였다. 그러나 일반적으로 RNA 중합효소III(polIII)의 전사 작용으로 생성된 saiRNA 말단은 길이가 비교적 긴 3’ 단 오버행은 직접 Ago2에 의하여 고효율적으로 식별되고 결합될 수 없으므로 saiRNA의 가공 및 침묵 기능에 영향을 미쳤다. 그러므로 연구팀은 saiRNA의3’ 말단에 특수한 리보자임(HDV ribozyme)을 융합하여 해당 리포자임의 고효율적 자가 절단 활성으로 정확하게 saiRNA의 3’ 말단에 2개 염기를 오버행시켜 saiRNA 전구체와 Ago2 단백질의 결합 효율을 대폭 증가하여 saiRNA가 표적 유전자에 대한 침묵 효율을 뚜렷하게 증강하였다. 해당 리포자임으로 개선한 saiRNA는 기존의 shRNA에 비하여 오프 타킷 작용이 적고 내인성 miRNA에 미치는 영향이 적다. 그러므로 동일한 침묵 효율 조건에서 saiRNA가 생성한 성숙된 siRNA가 세포내에서 축적량이 shRNA에 비하여 아주 적은 것으로서 Ago 단백질에 대한 사용량이 많은 것을 해결하였고, 가공 과정에서 Dicer 등 miRNA 가공에 필수적인 단백질 분자를 요구하지 않으므로 세포 내인성 miRNA에 대한 가공 및 기능에 대한 경쟁 작용을 대폭 감소시켜 과학 연구 및 유전자 치료 응용에 더욱 좋은 도구를 제공할 수 있을 것으로 전망된다. 정보출처 : http://www.stcsm.gov.cn/xwpt/kjdt/342463.htm